局部miR—126基因治疗促进小鼠缺血后肢血管新生的观察(2)
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参见附件。
2.6 统计学方法：统计结果用SPSS13.0统计学软件进行分析，以平均值±标准差表示，两两均数比较用t检验，多组均数比较用单因素方差分析。
3 结果
3.1 重组腺病毒microRNA-126构建、纯化、滴度测定：见表1。重组腺病毒包装、扩增后，应用滴定法测定病毒的滴度(TCID50)。
病毒TCID50 为：T=101+d(9.5-0.5)=101+1×(9.5-0.5)=1.00×1010TC ID50/ml，换算为病毒的PFU 滴度为：T=1010-0.7=109.3=2.00×109(PFU/ml)，用时稀释成1.00×109(PFU/ml)。
3.2大体观察：各组0～14天从外形皮色、皮温及肌肉萎缩状况观察，三组0～7天差别不很明显。7～14天A、B组较C组相对皮色淤青明显、肌肉有轻度萎缩、后肢中段周经测量稍小，平均相差约0.5mm。
3.3 组织学检测
3.3.1 HE染色：第7天C组：低倍镜下萎缩纤维中有再生肌纤维，无明显新生血管；高倍镜见内皮细胞肿胀明显，有明显的血管芽，个别有新生血管腔形成；A组：低倍镜下肌萎缩明显，高倍镜见内皮细胞扁平，呈梭形；B组：低倍镜下肌萎缩明显，炎症明显，高倍镜见内皮细胞扁平，呈梭形。图1～3。
第14天C组低倍镜血管肉芽组织增生，有大量新生血管增生，高倍镜下血管内皮细胞肿胀、增生，有大量血管腔形成；A组低倍镜有肌萎缩，未见明显肉芽组织增生，高倍镜有少量血管内皮细胞增生，少见新生血管形成；B组低倍镜有肌萎缩，未见明显肉芽组织增生，高倍镜有少量血管内皮细胞增生，少见新生血管形成。图4～6。
3.3.2 CD31免疫组化染色：第7天高倍镜下C组较A、B组CD31标记的内皮细胞增生明显，有血管芽形成，未见明显新生血管腔。图7～9。
第14天低倍镜下C组较A、B组CD31标记的内皮细胞增生明显，有大量血管芽形成及明显多的新生血管腔形成。结果表明C组的标记CD31阳性的血管内皮细胞较A、B组明显增多。图10～12。
3.4 实时定量PCR检测miR-126的表达水平：①Cr：重组腺病毒miR-126 C57小鼠右侧后肢组；②阴：正常C57小鼠左后肢组；③A：C57小鼠左侧缺血后肢手术组；④B：空病毒C57小鼠左侧缺血后肢手术组；⑤Cl：重组腺病毒miR-126 C57小鼠左侧缺血后肢手术组。图13。
设阴性组3天的miR-126的表达量设为1，各组数据为相对表达量，即平均值±标准差。统计分析采用Student's t test。阴性组与Cr组在3day，7day，14day均无统计学意义(P>0.05)。阴性组与A、B、Cl组均有统计学意义(P<0.05)。A组与B组在3天，7天，14天均无统计学意义(P>0.05)。Cl组在3天，7天，14天与其他组均有统计学意义(P<0.05)。
结果表明A组缺血组织中的miR-126水平在术后明显降低，尤其第7天，降低最明显，14天有回升，但未及正常水平。C组术后miR-126水平呈上升趋势，尤其是第7天达最高水平，14天水平有回落，但仍高于正常水平。这与组织学检测的结果正好相符。Cr组的miR-126水平与阴性组相一致，说明体外重组腺病毒miR-126局部注射于小鼠缺血后肢，可以明显增加缺血局部组织中miR-126水平的表达，而不影响其它部位miR-126的水平。
3.5 western blotting监测分析：见图14。各组数据为相对表达量，即平均值±标准差。统计分析采用Student's t test(*P<0.05，**P<0.01)。
结果显示C组较B组、A组中ERK1/2、、AKT、pERK1/2、pAKT的蛋白表达水平明显增高。表明缺血组织局部被动高表达miR-126，可以明显的增加ERK1/2、、AKT、pERK1/2、pAKT蛋白水平的表达，说明miR-126是激活了VEGF、FGF等生长因子介导的MAPK和PI3的信号通路。
4 讨论
组织移植是整形外科和烧伤外科等学科临床上最常用的治疗手段，移植组织术后存活的基本条件是在移植组织耐缺血时限之内及时重建血液循环，血运重建的时间和质量与移植组织的存活及存活质量有密切的关系。
临床实践中组织移植术后，移植的组织通过与受区重建血液循环而存活。通常较薄的组织(如皮片移植)和体积较小的组织(如少量的颗粒脂肪移植)比较容易建立血运而易于存活，而较厚的组织(如真皮下血管网皮片移植)和体积较大的组织(如大量脂肪注射、大块的组织工程组织移植)，往往因为不能在耐缺血时间内及时、有效的重建血液循环而不易存活，这也就是真皮下血管网皮片移植、大量脂肪移植等，目前在临床广泛应用中面临的巨大难题，因此移植术后能否及时、有效的重建血运是提高移植组织存活率和存活质量的关键。另外，冠心病、脑梗死、肢端缺血性坏死等缺血性病变仍是临床上十分常见的疾病，这些缺血疾病转归的关键也是及时、有效的重建血运。重建血运的重要途径就是促进缺血局部的血管新生，改善缺血局部血供，利于缺血局部功能恢复。
血管新生主要是由于机体受到各种病理或生理上的刺激 ......
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