组织工程软骨实验生物反应器的设计(1)
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[摘要]目的：设计一套计算机控制的组织工程软骨实验用灌流型生物反应器。方法：通过计算机控制时间及流量，利用蠕动泵、密闭的硅胶管、玻璃管、储液瓶等串联设计一套无菌的灌流型软骨组织工程用生物反应器。 结果：生物反应器由控制系统和培养系统组成，运行良好，能置于培养箱中对软骨细胞材料复合物进行动态培养。结论：反应器设计合理。整个生物反应器系统运行可靠。
[关键词]组织工程；软骨；生物反应器
[中图分类号]R318[文献标识码]A[文章编号]1008-6455(2007)10-1328-03
Design of a bioreactor for constructing tissue engineered cartilage
HAN Xue-feng1,LI Jian-ning1,YANG Da-ping2,QIN Ze-lian1,HAO Chen-guang2,LIU Guo-feng2,GUO Tie-fang2，XU Jie3
, 百拇医药
(1.Department of Plastic Surgery，the Third Hospital of Beijing University； 2.Department of the 1st Orthopedic Surgery，the Second Hospital of Haerbin Medical University; 3 Department of General Surgery, the Shanghai Tenth People's Hospital of Tongji University, Shanghai 200072)
Abstracts:ObjectivesTo design a set of perfusion bioreactor which controlled by computer for constructing tissue engineered cartilage.MethodsTo control the rate and time of the flow by computer, and to construct a set of sterile perfusion bioreactor for cartilage tissue engineering, which was consist of peristaltic pump, plastic tubes, silicon gel tubes and media container in series.ResultsThe bioreactor was composed of control system and culture system,which moved well.The bioreactor can be put into incubator and culture cartilage in dynamic state. ConculsionThe bioreactor was resonable and reliable.
, 百拇医药
Key words: tissue engineering; cartilage; bioreactor
关节软骨损伤后，自身能力修复有限，大于4mm的缺损需利用软骨或其他材料修复。软骨组织工程为软骨修复提供又一有效途径。正常状态下，关节软骨间断受到应力，如直接压力，关节液的流动产生的剪切力等。为促进组织工程软骨体外成熟，很多作者引入灌流型生物反应器(Perfusion Bioreactor,PBR)来模拟体内应力环境[1-4]，并取得良好效果。但前人设计的PBR普遍存在容量小，成本昂贵，如需不同时间取材则实验耗时长等缺点。本实验设计的生物反应器通过计算机控制不同时间、流量的培养液流动，模拟体内的应力环境；并将多个反应箱串联，可于短期内培养大量不同时间取材的组织工程软骨，以期改进PBR的功能。
1材料和方法
1.1 灌流型生物反应器的设计原则：生物反应器(Bioreactor,BR)是于体外向组织工程组织施加外力，以促进后者成熟的仪器。其可促进营养物质交换，并使组织工程组织处于类似体内的力学环境，从而提高后者生物学及力学性能。为达以上效果并方便实验研究，软骨组织工程PBR应遵循以下原则设计:可提供流体的剪切力；能够促进营养物质代谢；可调节流量及作用时间；具有多个反应箱，可在短期内获取大量的标本；系统透明，便于观察；培养室的设计能保证培养液均匀地流过；成本低廉，制作、使用方便；污染可能性小等。
, 百拇医药
1.2 灌流型生物反应器的实验材料：工控计算机，华北工控有限公司生产。蠕动泵，型号BT300-1J，河北保定兰格恒流泵有限公司生产。硅胶管，pharmed蠕动泵细胞培养专用硅胶管，法国圣戈班公司生产。开关(不锈钢输液调节器)，不锈钢滤网及所有玻璃器皿、玻璃管道、胶塞均为哈尔滨一统化学化玻设备厂生产。
1.3 灌流型生物反应器的设计：PBR是一套无菌的封闭循环系统，由控制器、蠕动泵、储液瓶、反应箱以及连接管道组成(图1、图2)。控制器即计算机，其内装应用软件Matlab，经本实验室人员许杰[5-6]编程后可任意控制液体流量缓慢升高、降低、往返流动及作用时间。蠕动泵通过采集卡与计算机相连，接受计算机的指令，流量为0～100ml/min。储液瓶内可储存培养液250ml，每周换2次液，每次换出80ml。瓶口由胶塞封闭，其上连接2个直径0.22μm的一次性塑料滤膜，1个为通气滤膜，保持培养液的气体环境，1个为换液滤膜，新鲜的培养液通过其注入储液瓶中，确保注入液体无菌；其上连接的2个玻璃管道均探入瓶底，保证液体往返流动时整个管道无气体进入。反应箱由内径5mm，管壁厚度0.5mm，长度3.5cm的玻璃管构成，每一反应箱内放入1个标本，各反应箱由硅胶管连接,其间由100目不锈钢滤网间隔，防止标本随液流冲走。连接管道由玻璃直管及三通、硅胶管、一次性塑料三通、开关组成。玻璃管内径5mm，管壁厚0.5mm，直管长度分别为4cm和12cm，三通呈150，150，60度角度，各臂长4cm。硅胶管内径5mm，管壁厚度3mm，可与玻璃管紧密贴合。一次性塑料三通为换液时使用，将需要换掉的液体从储液瓶中抽出，而不从此向内注液，减少污染机会。开关作用：将标本置于反应箱后，硅胶管旁路的开关全部关闭，反应箱两侧开关打开，培养液串联流过标本，每一标本所受外力相同。在第一次取材时，关闭第一组反应箱两侧开关，打开硅胶管旁路开关，取出标本，而不影响余下标本的实验。第二次取材时依此类推，可以在短时间内获取大量标本。整个系统除蠕动泵及计算机外均可以通过高温高压消毒。
2结果
PBR已设计制作完成。实物布置如图2B所示。蠕动泵及计算机置于孵箱外。系统体积小，安放灵活，可任意放置于托盘上。整个系统运行良好、稳定。
3讨论
常规的静态培养条件下，组织工程组织易形成“空巢”现象。其原因主要是由于支架中心部位低分子的代谢产物主要通过渗透的方式向表面转移，不利于细胞代谢废物的排泄及营养物质的摄取，最终导致细胞向支架表面迁移，中心部位形成组织量较少，出现“空巢”[7]。同时，因培养环境与体内生理应力环境相去甚远，形成的组织工程组织力学特性与生理性组织也有一定差距[1-3,7-10]。, 百拇医药(韩雪峰 李健宁 杨大平 秦泽莲 郝晨光 刘国锋 郭铁芳 许 )